Fils de Jacques-Philippe Marin Labiche (1786-1864), riche industriel, et de Marie-Louise Aglaé Falempin (1787-1833), commerçante, de leur union en 1813 célébrée à Paris naît Eugène Labiche le 6 mai 1815.
Fils unique, Eugène Labiche passe son enfance à Rueil-Malmaison où ses parents, fortunés, dirigent une usine de sucre. A la rentrée scolaire d'octobre 1826, il est inscrit au collège royal de Bourbon (Lycée Condorcet aujourd'hui). Interne à la pension Labbé, il y reste jusqu'en 1833, année où il obtient son baccalauréat de lettres à 18 ans. La même année, sa mère décède et lui lègue une maison dans Paris. De janvier à juillet 1834, avec des camarades, il effectue un voyage dans le Sud de la France, en Italie et en Suisse. De retour à Paris en septembre, il s'inscrit à l'École de Droit pour préparer une licence.
Attiré depuis toujours par la littérature, Eugène Labiche collabore à plusieurs revues artistiques et littéraires, se lance dans le journalisme, et fait représenter une première pièce de théâtre, La Cuvette d'eau, en 1837. A partir de cette année, il ne quittera le domaine de la dramaturgie
qu'en 1877, date de sa dernière production. En 1839, il publie son premier roman, La Clé des champs, qui sera l'unique de toute sa carrière. Il se consacre ensuite exclusivement au théâtre, en faisant jouer au total 174 pièces en 40 ans. En 1849, il est élu membre de la commission de la Société des Auteurs et Compositeurs dramatiques, en qualité d'archiviste. Dans les années 1860, il connaît ses plus grands succès parmi lesquels Le Voyage de monsieur Perrichon (1860), La Poudre aux yeux (1861), La Station Champbaudet (1862), La Cagnotte (1864), Le Papa du prix d'honneur (1868) et Le Choix d'un gendre (1869). Le 26 février 1880, Eugène Labiche est élu à l'Académie française, et reçu par John Lemoinne le 25 novembre 1880. Après le relatif échec de La Clé, une comédie en quatre actes publiée en 1877, à 62 ans Eugène Labiche prend la décision de ne plus écrire.
Le 25 avril 1842 à Paris, Eugène Labiche épouse Marie Adélaïde Hubert, dite Adèle (1823-1914). Adèle est la fille d'un riche minotier, Jean-Baptiste Hubert (1795-1889), et propriétaire du château de la Grange-le-Roi à Grisy-Suisnes en Seine-et-Marne. Le couple n'aura qu'un seul enfant, André Marin Labiche, né le 12 mars 1856 et décédé le 29 décembre 1897.
Après plusieurs années de sérieux problèmes cardiaques, Eugène Labiche décède à son domicile le 22 janvier 1888 à l'âge de 72 ans, et repose au cimetière de Montmartre à Paris. Adèle, son épouse, est décédée en septembre 1914, à l'âge de 91 ans.